Podłoże mikrobiologiczne, zwane też pożywką to sztucznie stworzone środowisko, będące mieszaniną różnych substancji odżywczych, które służy do hodowli drobnoustrojów. Dobrze przygotowane podłoże powinno zawierać substancje z łatwo dostępnymi pierwiastkami biogennymi tj. węgiel, tlen, wodór, azot, fosfor, siarka, mieć odpowiednie dla wzrostu danego drobnoustroju pH, a także charakteryzować się odpowiednim stopniem wilgotności i wartością ciśnienia osmotycznego.

podloze mikrobiol agar2

Podłoże mikrobiologiczne
Źródło: http://www.biomerieux.pl/

Koniecznym warunkiem do zainicjowania hodowli drobnoustrojów jest jałowość podłoża. Oznacza to, że pożywka jest pozbawiona wszelkich żywych organizmów, form wegetatywnych i przetrwalnych. Jałowe podłoże można uzyskać poprzez proces sterylizacji. Sterylizację podłoży płynnych możemy przeprowadzać w klasycznych autoklawach (czas procesu 45-90 min) lub też w nowoczesnym urządzeniu do sterylizacji Microjet (czas procesu 7-15 min).

Podłoża mikrobiologiczne może podzielić według kilku kryteriów. Ze względu na konsystencję wyróżniamy podłoża płynne, półpłynne i stałe. Podłoża płynne służą głównie do namnażania drobnoustrojów. Podłoża półpłynne zawierają dodatek 0,1 – 0,7 % agaru służą do namnażania drobnoustrojów o mniejszym zapotrzebowaniu na tlen, a także do badania ruchu bakterii.

microjet-white

Microjet

Podłoża stałe o zawartości agaru od 1,5 % do 2 % przede wszystkim wykorzystywane są do różnicowania drobnoustrojów, choć mogą służyć także do ich namnażania. Agar to uniwersalny, stosowany powszechnie w mikrobiologii czynnik zestalający pożywki uzyskiwany z morskich krasnorostów, który rozpuszcza się w wodzie na gorąco w temperaturze 100°C, krzepnie zaś w temperaturze 45°C. Niekiedy zamiast agaru stosuje się żelatynę, produkt hydrolizy kolagenu otrzymywany z wygotowanej skóry, ścięgien i kości zwierzęcych, jednakże żelatyna upłynnia się już w temperaturze 22-25°C co znacznie utrudnia hodowlę drobnoustrojów.

Ze względu na zawartość substancji odżywczych podłoża mikrobiologiczne dzielimy na, minimalne, pełne i wzbogacone. Podłoża minimalne zawierają tylko te składniki pokarmowe, które są absolutnie niezbędne do podtrzymania wzrostu drobnoustrojów. Podłoża pełne w swoim składzie posiadają wszystkie niezbędne substancje odżywcze, w tym źródła pierwiastków biogennychsole mineralne, czynniki wzrostu, zapewniając tym samym maksymalny wzrost drobnoustrojów. Podłoża wzbogacone to takie, które w swym składzie zawierają dodatkowe związki umożliwiające wzrost mikroorganizmów słabo rosnących.

laboratory4

Praca w laboratorium mikrobiologicznym
Źródło: http://pl.wessling-group.com

Jako substancje wzbogacające stosuje się krew, surowicę, płyny wysiękowe, wyciąg wątrobowy, mleko, żółtka jaj.
Podłoża mikrobiologiczne możemy dzielić także ze względu na skład chemiczny. Wyróżniamy tutaj podłoża naturalne, półsyntetyczne i syntetyczne. Podłoża naturalne sporządza się na bazie składników pochodzenia naturalnego np. wyciągi mięsne, wyciągi warzywne, hydrolizaty białek. Ich skład chemiczny nie jest w pełni zdefiniowany. Podłoża półsyntetyczne są częściowo poznane pod względem ich składu chemicznego, zawierają one zarówno składniki pochodzenia naturalnego jak i składniki syntetyczne. Podłoża syntetyczne mają ściśle określony skład chemiczny. Podłoża półsyntetyczne i syntetyczne mogą być w zależności od ich składu minimalne, pełne lub wzbogacone.

Najbardziej przydatnym ze względów praktycznych kryterium podziału podłoży mikrobiologicznych jest jednak podział ze względu na ich zastosowanie. Wyróżniamy tutaj sześć głównych grup podłoży: transportowe, transportowo-wzrostowe, namnażające,selektywne, różnicujące, oraz wybiórczo-różnicujące.

probki z podlozem transportowym

Próbki z podłożem transportowym
Źródło: http://www.borpol.com.pl

Podłoża transportowe to podłoża minimalne, których zadaniem jest utrzymanie żywotności drobnoustrojów w czasie transportu, ale nie pozwalają one na ich namnożenie. Używane są do transportu próbek materiału klinicznego i szczepów drobnoustrojów do laboratorium. Podłoża transportowo-namnażające umożliwiają namnażanie drobnoustrojów podczas przechowywania, transportu i inkubacji materiału klinicznego. Podłoża namnażające to podłoża bogate gwarantujące dogodne warunki wzrostu dla wielu grup drobnoustrojów. Podłoża selektywne, zwane też podłożami namnażająco-wybiórczymi mają taki skład, który gwarantuje dogodne warunki do wzrostu określonych drobnoustrojów przy równoczesnym zahamowaniu rozwoju pozostałych. Podłoża różnicujące, inaczej izolacyjne, zapewniają warunki do wzrostu różnych drobnoustrojów, jednak obecne w ich składzie czynniki różnicujące umożliwiają ich rozróżnienie na podstawie identyfikacji określonych cech (np. zdolności do hemolizy danego cukru). Do tej grupy zaliczane są m.in. komercyjne podłoża chromogenne, których wynik stanowią charakterystycznie zabarwione kolonie. Podłoża wybiórczo-różnicujące łączą w sobie właściwości pożywek różnicujących i selektywnych, dzięki czemu umożliwiają różnicowanie określonych rodzajów/gatunków drobnoustrojów przy jednoczesnym hamowaniu wzrostu flory towarzyszącej.

Obecnie na rynku dostępne jest wiele gotowych komercyjnych podłoży mikrobiologicznych i w takim wypadku to producent odpowiedzialny jest za zapewnienie ich optymalnego składu, jakości i przede wszystkim sterylności. Jednakże wciąż nie mniej popularne i użyteczne jest samodzielne przygotowanie podłoży ze składników podstawowych (będących najczęściej w formie proszków i granulatów). Przygotowując samodzielnie podłoże należy pamiętać o kilku podstawowych kwestiach. Po pierwsze należy poprawnie przeliczyć ilości poszczególnych składników na zadaną objętość pożywki zgodnie z podanym dla niej protokołem, a następnie ilości te dokładnie i starannie odważyć na wadze laboratoryjnej, przesypać do suchej, czystej butelki, kolby, lub innego naczynia i opisać każde z nich. Źle obliczone, lub źle odważone proporcje składników wpłyną na właściwości naszego podłoża i mogą spowodować, że nie spełni ono swojej funkcji.

mieszadlo

Mieszadło magnetyczne

Kolejnym krokiem jest dopełnienie pożywki wodą destylowaną do zadanej objętości i dokładne wymieszanie składników, aż do ich rozpuszczenia (jeśli przygotowujemy podłoże w dużej objętości warto skorzystać z mieszadła magnetycznego). Ważne jest aby użyta woda była świeża, o znanym składzie i właściwościach fizykochemicznych.

Ostatnim i kluczowym w praktyce mikrobiologicznej etapem przygotowania podłoży jest ich sterylizacja. W celu kontroli sterylizacji na naczynia należy nakleić taśmę ze wskaźnikiem sterylizacji. Jeśli podłoża przygotowujemy w kolbach, przed sterylizacją należy je zakorkować, natomiast korki na butelkach zostawiamy luźno zakręcone. Biorąc po uwagę fakt, że podłoże w trakcie sterylizacji będzie się gotować, objętość podłoża nie powinna być większa niż 1/3 całkowitej objętości naczynia – to pozwoli uniknąć wykipienia pożywki z naczynia. Przed umieszczeniem podłoży w autoklawie należy pamiętać aby uzupełnić poziom wody w urządzeniu. Sterylizację możemy przeprowadzać w klasycznym autoklawie, zwanym potocznie szybkowarem, gdzie proces ten trwa 45-90 min (w zależności o wydajności systemu grzewczego urządzenia) lub też w urządzeniu Microjet, które wykorzystuje nowoczesną technikę mikrofalową zapewniającą szybkie i równomierne ogrzewanie dzięki czemu cały proces sterylizacji trwa zaledwie 7-15 min.

mikrofale13

Należy pamiętać, aby procesowi sterylizacji (względnie co najmniej filtracji) poddać także wszelkie składniki, związki czy też roztwory, które zamierzamy dodać do podłoża przed zaszczepieniem hodowli (np. aminokwasy przy hodowlach drożdżowych, związki toksyczne dodawane do podłoży stałych w zadanych stężeniu przed ich wylaniem na szalki) chyba że producent zapewnił o ich sterylności.

Tekst przygotowała:
Karolina Stępień